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ibidi血管生成、侵袭等实验现象
发布时间:2016-08-24   点击次数:1917次

卡西波肉瘤是一种发生在包括口腔在内的多种组织内的,具有极强的血管生成能力和侵袭能力的恶性肿瘤。卡西波肉瘤KS已经被鉴定出多种细胞标记物,但是其来源依然是一个迷。美国的科学家之前发现卡西波肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV)能够使大鼠的原代间充质干细胞(MSCs)感染,变形,并且重新编辑,使其分化为类卡西波肉瘤细胞。在这次的实验中,科研人员使用KSHV感染由多种组织来源的人原代间充质干细胞,包括骨髓(MSCbm),脂肪组织(MSCa),牙髓,牙龈组织(GMSC),和乳牙。科研人员成功的建立起来KSHV感染的MSCa,MSCbm和GMSC(LTC-KMSCs)的稳定株。其中,这些细胞表达了混合的KS标记物,并且显现出不同的血管生成、侵袭和变形的现象,而LTC-KMSCs表现出比未感染细胞更低的增殖率。进而研究人员发现KSHV介导的血管生成是通过KSHV介导的microRNA激活了AKT通路。这些研究说明,在人体内MSCs是KSHV的靶细胞,会建立起多种KSHV感染的模型。

 

研究人员采用各种MSCs,铺在基质胶上,孵育8小时,对比不同细胞的分枝数和节点数。

 

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L。 Wood, N。 Cox, C。 Phelps, S。 Lai, A。 Poddar, C。 Talbot and D。 Mu

Scientific Reports, 2016, 10。1038/srep19857

 

(一)实验材料和实验方法

1)细胞:  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2)培养基:      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3)基质胶:    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4)耗材:    ibidi血管生成载玻片  (ibidi, 81506)

5)其他:        细格纸                                  

 

(二)实验步骤

1)准备基质胶

① 将10μl的Basement membrane以5mg/ml的浓度铺入ibidi血管生成载玻片的内孔中,注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。

② 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。

③ 准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。

④ 将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖上培养皿盖。

⑤ 37℃至少孵育30分钟,使基质胶固化。

怎么知道加了合适体积的Matrigel:

由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔,这样,必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。

 

如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。

 

 

3)铺细胞

 

① 每孔种10000个细胞即可。准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。

② 将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。

③ 每孔加入50μl的细胞悬液,注意保持枪头垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。

④ 同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液体正好加满。

⑤ 盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。

 

4)采集图像并统计结果

37度 5% CO2孵育8小时后,使用尼康Eclipse E400荧光显微镜采集图像,并其分枝数和节点数进行测量和统计。

 

三)实验结果

 

对比LTC-KMSCs几种细胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的间充质干细胞,KSHV会增强血管形成效果。图像是铺细胞后8小时采集,100倍放大倍数。

 

  1. 为了研究KSHV相关的miRNA的作用,对比了未被感染MSCs(Mock),感染的MSCs(KSHV)和用10个pre-miRNA簇缺失的突变病毒感染的MSCs(ΔmiR)和用这一突变的KSHV稳转的MSCs(ΔmiR Vector);以及用逆转录病毒重新表达这10个miRNA簇(ΔmiR Cluster)这几组细胞的血管生成。发现这几个miRNA对于细胞的血管形成有着非常重要的作用。(B) LY294002一种磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制剂,对于LTC-KMSCa血管形成有明显的抑制作用。并且随着LY294002浓度的上升,抑制作用会增强。两组结果均是铺细胞8小时后以100倍放大倍数采集图像。

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